今回使用するプラスミドのNovagen pET-43.1a(+)には、NusAタンパク質遺伝子がコードされています。そして発現により産生したNusAタンパク質にはHis・Tagが付加されるため、His Bind Purification Kitで容易にアフィニティー精製が可能です。
このプラスミドをコンピテントセルBL21にトランスフォーメーションさせ、OEではそのまま培養、対照のLB培地で培養するほうでは対数増殖期に相当するOD=0.6付近で発現誘導物質IPTGを添加しました。
培養終了後は、 BugBuster®Protein Extraction Reagentを使用してトータルタンパク質の抽出、続けてHis・Bind®Purification Kitを使用してNusAタンパク質を精製しました。確認はSDS-PAGEで行いました。

（1）トランスフォーメーション(大腸菌の形質転換)

氷上で冷やしておいた空のマイクロチューブそれぞれに、トランスフォーメーション用、ポジティブコントロール用、ネガティブコントロール用にコンピテントセルを入れました。


次にトランスフォーメーション用にはプラスミドpET-43.1a(+)DNAを1μl（1ng）を入れ、ポジティブコントロール用には付属のテストプラスミドを1μlを加えました。ネガティブコントロール用には何も加えませんでした。


氷上で5分間静置しました。


42℃のアルミブロック恒温槽にさして、30秒間ヒートショックしました。 その後再度氷上で2分間静置しました。SOC培地80μlを加え、トータル100μlにしました。

（2）前培養

0.9mlのLB培地の入った15ml遠沈管に、形質転換溶液100μlを入れました。


キャップを空気が入る程度に弛めに閉め、バイオシェーカーのスプリングネットに、 培養液の通気・攪拌をよくするために、スピッツ管を斜めに挿しました。


37℃・180rpmで1時間往復振とうしました。

（3）トランスフォーメーションチェック

アンピシリン（終濃度50μg/ml）を含んだLBアガープレートを用意しました。


それぞれの前培養液から100μlを区分線を書いたプレートにプレーティングしました。 次に37℃にしたインキュベータに入れ、一晩静置培養しました。


ネガティブコントロールの領域にはコロニーは形成されておらず、トランスフォーメーション（NusA）の領域と ポジティブコントロールの領域にコロニーが形成されていることを確認しました。 この結果からトランスフォーメーションが完了したと判断しました。

（4）本培養

炎で滅菌したピンセットで爪楊枝をつまみ、爪楊枝全体をかるく炙って滅菌しました。 爪楊枝の先端をブルーコロニーに触れ、爪楊枝をOEメディウムの入った遠沈管に投じました。


空気が入る程度にキャップを弛めに閉め、37℃・180rpmで往復振とうしました。 対照のLB培地+IPTGで発現誘導する従来法では、OD600=0.54の時点でIPTGを終濃度1mMになるように添加しました。 本培養時間は両者ともに24時間としました。培養終了後のOD値はODOE=4.3、ODLB=3.0でした。

（5）タンパク質抽出・精製

本培養液1.5mlを2.0ｍｌマイクロチューブにとり、10,000×gで10分間遠心して集菌し、上清を除去しました。


300μlのBugBuster Extraction Reagentを加え、 DNA，RNAを消化するために0.3μlのBenzonase　(25U/μl)加えて懸濁しました。 これにより、溶液の粘性が低下し、さらさらした状態になりました。



目的のタンパク質NusAにはHis・Tagが付いているので、メルク社のHis Bind Purification Kitを使用して、精製しました。 操作は付属のマニュアルにしたがい、各バッファーを入れて転倒攪拌、遠心を繰り返しました。

（6）たんぱく質の確認SDS-PAGE

スラブ式ゲル電気泳動セットに、SDSゲルを充填したガラスをセッティングし、 バッファー槽にトリス-グリシン-SDS泳動バッファーを注ぎました。


泳動セッティングしたSDSアクリルアミドゲルの各ウェルに、 サンプルバッファーと混合したタンパク質試料をマイクロピペットでチャージしました。


20mA定電流で、100分間の泳動をしました。


ゲルを酢酸メタノール固定液で10分間×2回振とうした後、クマシーブルー（CBB）染色液の入った 容器に入れて８の字振とう機で30分間振とうしました。

2007-07-20 15:41:32