概要

合成リガンドレジンMEP HyperCelによる無血清培地からのマウスIgG1の精製を報告する。 MEPはProtein AやProtein Gと比べて

由来生物種や抗体のサブクラスが不問

弱酸性溶出（pH4で溶出、Protein AやProtein GはpH2.8前後が一般的）でタンパク質の失活リスクを低減

アルカリ洗浄による繰り返し使用

生物由来材料の不使用の点で有利である

しかし、イオン交換疏水的相互作用を基盤とした精製なので、蛋白質種が多い場合は高純度に精製することはできない。無血清培地でも比較的高濃度のアルブミンを含む培地も多く、合成リガンドによる精製では抗体と分離できないことが多い（参考資料）。
本実験では、精製工程にオクタン酸ナトリウムによる洗浄を加えることにより、アルブミンの除去を試みた。その結果、89.2%のIgG1精製画分を得ることができた。工程の追加によるIgGのロスも認められないことから、洗浄工程の追加により初期精製においてMEP HyperCelで十分な性能を発揮できることがわかった。

材料と方法

材料

マウス由来IgG1産生ハイブリドーマの培養上清濃縮液
BD Cell MAb無血清培地（日本ベクトン・ディッキンソン、アルブミン1 mg/mLを含む）により培養したのち、LVセントラメイト（日本ポール）により細胞を除去、濃縮・脱塩を行った
（（蛋白質濃度3mg/mL、濃縮倍率：約20倍）

試薬

AcroSep MEP HyperCel（日本ポール）
（カラム容量：CVは1 mL）

機器

ペリスタポンプ
（アトー）
HPLCシステム
（Alliance Bio、ウォーターズ）
ゲルろ過カラム
TSK-GEL G3000SWXL（7.8×300mm 東ソー）
電気泳動装置
（Proteian III、バイオラッド）

実験方法

＜精製＞
精製は室温で流速0.5mL/minで行った。

濃縮培養上清試料0.5mLをPBSで10倍希釈し、試料5mL（蛋白質濃度3mg/mL）を調製。
カラムをPBSで平衡化　　5CV
試料全量をカラムに添加。
PBSで洗浄　　5CV
25mMオクタン酸ナトリウム溶液で洗浄　　10CV
超純水で洗浄　　10CV
50mM酢酸ナトリウムバッファーpH4.0で溶出　　10CV

＜ゲルろ過による純度検定＞
以下の条件によりゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分画を行い、
得られたクロマトグラムのピークの面積の比より、最終精製産物の純度を評価した。
ゲルろ過条件

流速　　0.5mL/min
溶媒　　50mMリン酸カリウムバッファー、300mM 塩化ナトリウム
pH（溶媒）　　6.9
検出波長　　280nm
カラム温度　　室温
サンプル温度　　10℃
分析試料量　　20μL
分析時間　　30min

＜SDS PAGEによる純度検定＞

最終精製産物および中間製生産物は、希釈率に合わせて体積を調整の後にSDS電気泳動を行った。

結果

ゲルろ過のクロマトグラムより最終精製産物のIgG純度は89.2%であった。
SDS PAGEの泳動像より、アルブミン除去のために追加した工程においてもIgGの解離は起こらず、これら工程ではアルブミンのみが溶出された。

考察

AcroSep MEP HyperCelからのアルブミンの除去（溶出）にはオクタン酸ナトリウムによる洗浄が有効である。このアルブミン除去法を用いることにより、AcroSep MEP HyperCelにより、無血清培地由来のハイブリドーマ上清から、初期精製としては充分な純度のIgGが得られる。

＜参考＞
MEP HyperCelによるIgG精製（オクタン酸ナトリウム洗浄工程なし）