アプリケーションノート: 原核生物からの効率的なプラスミドDNA精製
イントロダクション
プラスミドDNAは分子生物学とタンパク質研究に欠かせない要素です。この比類のないツールは分子生物学研究の根源であり、さまざまな宿主で組み換えタンパク質を発現させるために必要になります。各用途により必要となるプラスミドの量は変わりますが、精製は通常小スケールでの培養から開始します。かつて必要だった大スケールでの精製は、クローニング技術の進歩により小スケールで十分になり、プラスミドやミニプレップの処理数が大きく増加しました。現在では小スケールでの開発、すなわち半自動化または完全自動化を必要とする多検体処理が広く行われています。
様々なメーカーから、小スケールから大スケールに対応したプラスミド精製キットが販売されています。96ウェルフォーマットと同様、ミニプレップは単一の遠心チューブで行うことが出来ます。しかし完全にキット化された方法によって、エンドユーザーはコストアップを強いられています。そこでわれわれは大腸菌の培養液から効率的に清澄化、及びプラスミドDNA精製を行う費用効果の高い方法を開発しました。それは、最適化されたフィルタープレートによる溶解液の清澄化に続いて、高いDNA結合容量を持つフィルタープレートを使う精製方法です。
プラスミドDNAの精製では、細胞を溶解し、塩類を加えて界面活性剤を塩析させた後、サンプルを清澄化します。この清澄化ステップは細胞断片を除去するために必要です。遠心チューブを用いて精製を行っている場合には、通常、細胞断片の分離に遠心分離が用いられます。しかし遠心分離ではプラスミドDNAの精製をハイスループットで行おうとするとさまざまな問題が生じます。まずマルチウェルプレートでは細胞破片（通常ふわふわの浮遊物）をペレット化して上澄みを回収することはほとんど出来ません。また遠心分離には時間がかかること、ローターの許容サンプル数、マイクロチューブを使うことによる操作の煩雑さなどの問題があります。そして最大の問題は、堆積物がふわふわのペレットであるため、目的のプラスミドDNAの大部分をトラップしてしまうことです。
プラスミド精製プロセスにおけるDNA結合には、シリカベースのメディアとガラス繊維のメンブレンを使うことが標準的になっています。この方法ではカオトロピック塩がDNAの結合を促進し、中性のバッファー（TE Bufferや水など）でDNAを溶出する前に汚染物質を容易に除去することが出来ます。シリカベースのメディアを含むフィルタープレートを使えば、吸引濾過や遠心分離で目的量のプラスミドDNAを容易に得ることが出来ます。
自動化が容易な吸引濾過では、より早く処理でき、サンプル回収を最大にする洗浄ステップを追加することが可能です。濾過は吸引濾過または遠心分離で効果的に行うことが出来ます。そして、研究者が利用できるプロトコールの選択肢を比類のないほど最大限に広げます。このアプリケーションノートでは、DNA精製を吸引濾過法と遠心分離法で比較します。さらに、溶解液の清澄化に絶大な効果を示す、プレフィルターを持つフィルタープレートの有用性を示します。溶解液はプレフィルターによる濾過によって効率的に清澄化され、その画分が即座にDNA結合プレートへと移動します。
以下のプロトコールでは96サンプルプラスミド精製の、原核生物の培養液から始まり高純度DNAを得て終了するまでの一連のプロセスを示します。マルチウェルプレートでの濾過で行う溶解液清澄化とDNA精製は、プラスミド調製のプロセスを効率化するでしょう。この方法は、手動、半自動または完全自動のいずれにも適用することが出来ます。
材料と方法
- 清澄化用AcroPrep™アドバンスフィルタープレート1 mL
3 μmグラスファイバー/0.2 μm Supor®メンブレン(PN8175)。
350 μLプレート(PN 8075)も使用可能。
- DNA結合用AcroPrep™アドバンスフィルタープレート1 mL(PN8132)
- 2 mLディープウェルカルチャープレート
- コレクションプレート
- サンプル分析用 UV/Visクリアープレート
- 吸引マニホールド(PN 5017)
- 吸引/加圧ポンプ(PN13157)またはプレートホルダー付き遠心機
- プレートシェーカー
表１
溶解液清澄化とDNA結合プロトコール
- ディープウェルプレート(1ウェル当たり培養量1mL)を用い、目的のプラスミドDNAで形質転換した大腸菌を、抗生物質を添加したLB培地で37 ℃、一晩培養する。
- 5000 ×g、10分間遠心して培養プレートの大腸菌をペレットにし、上清をデカントにより除去する。
- 再懸濁バッファー 100 μLでペレットを再懸濁する。
- 溶解バッファー 100 μLを各ウェルに加え、2分間プレートシェーカーで振とうする。
- 中和バッファー 100 μLを各ウェルに加え、2分間プレートシェーカーで振とうする。
- 細胞溶解液を清澄化用プレート(PN8175)に移す。
- 350μLコレクションプレートの上にDNA結合プレートを置き、吸引マニホールドの底に設置し、吸引マニホールドを組み立てる（図１を参照）。
- 清澄化用プレートをマニホールドの上に置く。
図１ 溶解液清澄化のための吸引マニホールド組み立て方法
- 10 in.Hg (0.34 bar)で吸引濾過し、DNA結合プレートに回収する。12 in.Hg (0.41bar)以上で吸引濾過しないこと。
- 吸引マニホールドを取り外し、2 mL廃液回収用プレートをマニホールドの底に設置し、マニホールドの上にDNA結合プレートを移す。
図2 DNA結合のための吸引マニホールド組み立て方法
- 結合バッファー 300 μLを各ウェルに加え、ピペッティングにより混和する。
- 5 in.Hg(0.17 bar)以下でゆっくり吸引濾過し、濾液を除去する。DNAはメンブレンに結合している。
- 洗浄バッファー 400 μLで各ウェルを洗浄する。
- 吸引濾過し、濾液を除去する。2 mL回収用プレートを使用するか、または廃液とする場合は除去する必要はない。
- ステップ13、14を繰り返す。
- 吸水性タオルにフィルタープレートの底を押し付けて液滴を除去する。
- アルコールを完全に除去するために、5-10分以上、吸引濾過する。
- アルコールの除去を確実にするため、16の操作を行う。
- 溶出バッファー 70 μLを各ウェルに加える。DNA濃度を高めたい場合は、50 μLに容量を減らすことができる。しかし平均総回収量は減少する可能性が高い。
- 1分間室温でプレートをインキュベートする。
- 精製DNAの溶出は吸引濾過または遠心分離のどちらでも良い。
a. 吸引濾過〜吸引マニホールド内にDNase、RNaseフリーの清浄な回収プレートを設置する。吸引マニホールドの上部にフィルタープレートを取り付けて、15 in.Hgで1分間、すべての溶出バッファーが濾過されるまで、吸引濾過を行う(図3を参照)。
b. 遠心分離〜フィルタープレートをDNase、RNaseフリーの清浄な回収プレートの上部に設置し、1000 ×gで5分間遠心分離する。
図3 溶出のための吸引マニホールド組み立て方法
- OD 260/280を測定し、精製DNAの濃度を算出する。
- アガロースゲル電気泳動により精製したプラスミドDNAを分析する。
結果
図４ 濾過による効率的な清澄化
大腸菌溶解液を、遠心分離または清澄化用Pall AcroPrep アドバンスフィルタープレートを用いた吸引濾過によって清澄化しました。図4 に示されるように、どちらの方法でも開始時に比べ、夾雑物(OD320)は同様に除去されています。
図５ 清澄化用AcroPrep アドバンスフィルタープレートから完全に回収されるプラスミドDNA
3つの濃度のプラスミドDNAをTEバッファーで調製し、清澄化用AcroPrep アドバンスフィルタープレート(3 μm グラスファイバー/0.2 μmスポア径メンブレン、PN8075)で濾過しました。濾過前後のプラスミドDNAを比較した結果、それぞれの濃度で100 ％の回収を示しています(図5 を参照)。
図６ 清澄化されたpCAT DNAの高い回収効果
清澄化における大腸菌溶解液からのDNA回収効率を示すため、プラスミドDNAを溶解液に混ぜ、濾過して清澄化しました。また、同じプラスミドDNAを濾過した溶解液に加えました。それぞれのサンプルを電気泳動した結果を図6 に示しました。どのサンプルからも一本のきれいなバンドが同じ強度を示しており、濾過による清澄化においてDNAがほとんど失われていません。
図７ 他社製品よりもプラスミドDNAの収量が高いDNA結合用Pall AcroPrep アドバンスフィルタープレート
Pall製350 μL及び1 mL DNA結合プレートと他社製品の350 μL DNA結合プレートを使用して、大腸菌培養液からpCAT プラスミドDNAを精製しました。精製方法は、製造元が推奨するプロトコールに従いました。DNA結合用Pall AcroPrep アドバンスフィルタープレート1 mLで最も高いDNA濃度と収率を示しました(図7と表2を参照)。他社製品WのDNA濃度(155 ng/μL)は 高い値を示しましたが、回収液量が少ないために(〜30 μL)、収量は最も低い値を示しました(4.5 μg/well)。他社製品MのDNA濃度(108 ng/μL) は最も低く、収量は5.6 μg/wellでした。
表２ フィルタープレートを使用したDNA精製の収量比較
図8 DNA結合プレートで精製したpCAT DNAのアガロースゲル電気泳動解析
3種類のDNA結合プレートで精製した pCAT DNAのアガロースゲル電気泳動像を図8 に示しました。それぞれの回収液量は等しくするために、泳動前に65 μLに調整しました。サンプルはどれもスーパーコイル状のプラスミドDNAを示していますが、収量はそれぞれ異なっています。
図9 溶出は遠心分離と吸引濾過で選択可能。精製されたDNAの質と量にほとんど差は生じない
DNA結合用 AcroPrep アドバンスフィルタープレートの溶出条件を、遠心分離と吸引濾過で検討しました。pCATプラスミドDNAを持った大腸菌を溶解し、Pall製フィルタープレートを使用し、プロトコールに従ってDNAを精製しました。プレートを同時に用意し、1000 ×gでの遠心分離と、15 in.Hg(0.5 bar)での吸引濾過によって、DNA溶出を行いました。ウェルごとの回収量は溶出前後のレシーバープレートの重さを測ることによって決定しました。またその平均値を確認するために、ランダムにウェルを選んで計量しました。OD 260 nmと280 nmを測定し、DNAの精製度と濃度を求めました。調製したDNAはすべてスーパーコイル構造であり、ほぼ同じ濃度であることが図9 に示されています。また、それぞれの方法で得たDNAの精製度、濃度及び回収容量を表3に示します。遠心分離は吸引濾過に比べ、濃度と回収容量の両方で若干高い値を示しました。
表3 遠心分離または吸引濾過による溶出DNAの精製度と量的比較
表4 Pall DNA結合プレートによるpDNAのシーケンス結果
Pall DNA結合フィルタープレートと他社製品で調製した精製pDNAサンプルを、ABI3130XLシーケンサーで解析しました。それぞれのプレートから得たいくつものDNAを使用して、連続読み取り平均鎖長(CRL)とトレーススコアを分析しました。表４に示されるように、Pall AcroPrep アドバンスDNA結合プレートで得たpDNAのシーケンス結果は、他社製品Mと同等のCRLを示し、他社製品Wよりも長い値を示しました。さらに、トレーススコアは、他社製品Mと同等であり、他社製品Wよりも高い値を示しました。
考察
吸引濾過法は、遠心分離法に比べてプラスミド精製における溶解液の清澄化を短時間かつ効果的にします。プレフィルターを伴ったフィルタープレートの効果は絶大で、遠心分離の必要がなくなり、清澄化の時間を短縮します。清澄化用AcroPrep アドバンスフィルタープレートは、目詰まりを防ぐ大きな孔を持ったプレフィルターと、より厳密に夾雑物を除去する微細孔フィルターを備えています。その結果、微粒子を多く含む溶液でも目詰まりすることなく速い流量で濾過することが出来ます。加えて、これらのプレートによる細胞溶解液の濾過は、DNAの全回収が可能であり、サンプルロスの心配がありません。プラスミドDNAサンプルは一度の清澄化でDNA結合プレートによる精製へと進むことが出来ます。
DNA精製用のグラスファイバープレートは多種市販されていますが、すべてが等しい性能を示すわけではありません。貴重なサンプルを調製する際、DNAの精製回収量を最大にすることが研究者の願いであることを我々は分かっております。そこで、我々Pall Life scienceはDNA結合を最適化したガラスファイバーメンブレンを開発しました。DNA結合用AcroPrep アドバンスフィルタープレートは、他社製品に比べ約50％以上も高い結合容量を示します。また、精製プラスミドDNAのOD 260/280の平均値は1.97という高純度を示しています。これは、シークエンスやクローニングなどのアプリケーションに適したより高純度のDNAが得られることを意味します。
Pall製DNA結合用フィルタープレートは、他社製品と比べてより多くの回収液量が得られます。これは、DNAの溶出を遠心分離で行うか吸引濾過で行うかを問いません。(データ未掲載)。吸引濾過によって処理した場合、遠心分離よりも濃縮や溶出に少しロスが生じますが、他社製品よりも多くのプラスミドDNAが得られます。また、推奨する吸引濾過プロトコールでは、吸引濾過を備えたシステムで完全自動化が可能です。溶出の際に遠心分離にするか吸引濾過にするかは、エンドユーザーによって選択されます。その選択には、処理時間と利用できる実験材料、必要とするDNA総収量を考慮する必要があります。
結合バッファーについて
グラスファイバーメディアへのプラスミドDNAの結合は、細胞溶解液へカオトロピック塩を添加することによって促進されます。我々が推奨するプロトコールでは、グアニジン-塩酸塩（Gu-HCl）を使います。一方、ヨウ化カリウム（KI）を使用するプロトコールもいくつがあります。DNA結合用AcroPrep アドバンスフィルタープレートでも、ヨウ化カリウムによるプラスミド結合は可能ですが、溶出条件を最適化するためにステップの追加が必要です。この場合まずプレートを3Mの酢酸カリウム溶液で洗浄し、その後水洗浄する必要があります。処理後、プラスミドDNAの結合と溶出はプロトコールに変わりはありません。結合バッファーにヨウ化カリウムを用いる場合、OD 260/280値は2.2程度のより高い値を示すことに留意して下さい。加えて、OD 260の値は上昇し、測定値からするとDNA濃度を若干過大評価することになります。
要約
- 簡便で効率的なプロトコールによって、マニュアル操作、半自動または全自動の操作のいずれでも最大量のプラスミドDNAが得られます。
- 溶解液清澄化プレート上にプレフィルターが構成されることで、粒子が多いサンプルでも一貫した濾過が得られます。
- 高い結合容量を持つDNA結合プレートのメンブレンは、高品質のプラスミドDNAが最大限に回収できるように最適化されています。
- プレートウェルの構造により、最少のホールドアップ量で、高流速かつ均一な濾過が得られます。
- 排出部のチップ構造により、サンプルは直接レシーバープレートに流入するようになっており、二次汚染の心配はありません。
＜関連製品＞
AcroPrep 384ウェルフィルタープレート：ハイスループットサンプル処理用ハイパフォーマンス製品
AcroWell™96ウェルフィルタープレート：タンパク質・核酸に対し、高い結合容量を示します。
遠心分離デバイス：非特異的結合がほとんどないため、50μL以上60mL以内のサンプルを効率良く回収し、濃縮・精製します。
クロマトグラフィーレジン：バイオマーカー探索、プロテオミクスや薬剤開発において、タンパク質精製と分画を簡便化します。
我々のウェブサイト にお越し下さい。
2010-11-08 10:31:34
