• 分裂酵母　S.pombe
• シロイヌナズナ植物体　A.thaliana

• DEPC水
• RNA抽出用フェノール試薬（TRIzol、インビトロジェン株式会社）
• クロロホルム：イソアミルアルコール混液（CI溶液 24：１）
• 70%エタノール

• ビーズ破砕対応多目的スピンダウンミキサー バグクラッシャーGM-01（タイテック株式会社）

• 2.0mlマイクロチューブ（ワトソン、ネジ口、自立タイプ）
  ※クラッシャーとチューブの組合わせは破砕効率にとって重要なファクターです。
• ガラスビーズ　フジストンNo.06（直径0.35〜0.85mm、富士理化工業）
• ジルコニアビーズ（コスモバイオ株式会社）
• 金属クラッシャー（タイテック株式会社）

1. 酵母からの抽出
   
   
   1. 分裂酵母　(YPD培地で培養 1ml) スクリューキャップつきチューブに分注
   ↓
   2. 遠心分離　GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で5分間遠心、上清を捨てた
   ↓　　　　　　　　　　　　　　↓
   ↓
   ↓
   ↓
   ↓
   ↓
   
   液体窒素で凍結
   スクリューキャップをよく閉め、チューブを液体窒素中に入れる。液体窒素の蒸発が収まり、シューという音がしなくなったらチューブを取り出して氷上に置く。（図１）
   ↓　　　　　　　　　　　　　　↓
   3. TRIzol 500µl を注ぎ、ピペッティングで軽く懸濁
   ↓
   4. ガラスビーズを適量（図2）入れたチューブ、ジルコニアビーズ入りチューブ、金属クラッシャー入りチューブに懸濁液を移した
   ↓
   5. Mixing GM-01のミキシングモード（最高回転数）で10分間撹拌
   ↓
   6. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で10分間
   ↓
   7. 上清を新しい1.5mlチューブに移す（図３）…→ここで沈殿を検鏡し細胞の破砕具合を確認
   ↓←CI溶液　等ボリューム ＊＊
   8. Mixing GM-01ミキシングモードのフラッシュボタンを用いて数秒間
   ↓
   9. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で15分間
   ↓
   10. 上清を新しい1.5mlチューブに移す
   ↓←CI溶液　等ボリューム
   11. Mixing GM-01ミキシングモードのフラッシュボタンを用いて数秒間
   ↓
   12. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で15分間
   ↓
   13. 水相を新しいマイクロチューブに移す
   ↓
   14. イソプロパノール沈殿　×0.6〜1容積のイソプロパノールを注ぐ（目分量でよい）
   ↓
   15. 静置(室温、15分)
   ↓
   16. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で20分間
   ↓
   17. 沈殿
   ↓←wash with 70% EtOH 1ml
   18. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で5分間
   ↓
   19. 沈殿
   ↓←乾燥後20µlのDEPC水に溶解、Total RNA溶液とする
   ↓
   • 5μLを取り、ＤＥＰＣ水95μLで希釈後、分光光度計で濃度測定
   • 10μＬを１％TAEアガロースゲルにて泳動、純度を確認

   図1 液体窒素でサンプルを凍結 スクリューキャップをよく閉め、チューブを液体窒素中に入れる。 液体窒素の蒸発が収まりシューという音がしなくなったらチューブを取り出して氷上に置く。

   図2 ガラスビーズをチューブに注ぐ。分量は正確でなくても構わない。

2. 植物体からの抽出
   
   1. シロイヌナズナ植物体を水洗いして土を除き、紙タオルで軽く拭く
   ↓　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　↓

   植物体を剃刀で5mm幅程度に刻む（図3） ↓ ピンセットでスクリューキャップつきチューブ、またはジルコニアビーズ入りマイクロチューブに移す。各75ｍg ↓←液体窒素凍結 ※スクリューキャップつきチューブのサンプルにも、金属クラッシャーをセットする（図4） ↓←TRIzol 500µL

   植物体150ｍg ↓←液体窒素凍結 ↓←TRIzol 1000µL ↓←乳鉢で磨り潰す TRIzol が溶けたら500μLを取りマイクロチューブに移す

   ↓　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　　 　↓
   1. Mixing GM-01のミキシングモード（最高回転数）　 　　　 　↓
      で15分間撹拌†　　　　　　　　　　　　　 　 　　　　 　　↓
   ↓　　　　　　　　　　　　 　 　　　　　　　　　　　　 　↓
   2. Spin down GM-01のスピンダウンモード（最高回転数）で10分間
   ↓
   3. 上清を新しい1.5mlチューブに移す
   ↓
   4. 以下、a)の＊＊以下と同様の手順にてTotal RNAを抽出、泳動（泳動は、２０μLのDEPC水に溶かしたサンプルを各2μLアプライした）
      
      †15分攪拌後、ジルコニアビーズのチューブに入れた葉は全て透明になった。この段階で、小型棒温度計で各チューブ内の温度を測ったところ約15℃であった。
      
      

   図3 剃刀で5mm幅程度に刻み、チューブに移したところ

   図4 凍結した植物サンプルにTRIzol 500µlを加えた後に、金属クラッシャーをチューブにセットした。 金属クラッシャーは-20℃で使用直前まで冷やしておき、チューブへのセットは手早く行うと良好な結果が得られる。

結果

a.破砕前後の酵母、植物体の細胞の状態の観察

破砕前の分裂酵母

破砕後の分裂酵母 ガラスビーズ使用 ＋液体窒素凍結	ガラスビーズ使用 −液体窒素凍結

ジルコニアビーズ使用 ＋液体窒素凍結	ジルコニアビーズ使用 −液体窒素凍結

金属クラッシャー使用 ＋液体窒素凍結	金属クラッシャー使用 −液体窒素凍結

ガラスビーズ、ジルコニアビーズ、金属クラッシャーで破砕した各サンプルで酵母の細胞は粉々には砕かれていない。 サンプルの泳動結果からRNAは抽出されているので、細胞は破砕されているが細胞壁のゴーストが残っていると考えられる。

破砕前の植物体
	植物体の場合、液体窒素による凍結を破砕の前提条件として行った。 その理由として細胞内の液胞にあるRNA分解酵素によるRNAの分解を極力避けることが挙げられる。

破砕後の植物体 ジルコニアビーズ使用 ＋液体窒素凍結
	ジルコニアビーズでは細胞の破砕が確認された。しかし葉脈の周辺に細胞の破片が多く残っていることから組織から細胞を押し出しきれていない印象。
破砕後の植物体 金属クラッシャー使用 ＋液体窒素凍結
	金属クラッシャーも細胞の破砕が見られる。金属クラッシャーの方がより組織から細胞が押し出されている印象。両者共に葉脈など葉の固い構造は残っている。液体窒素で凍結＋乳鉢で磨り潰したものと比べると破砕は穏やかであり、破砕時に発生するデブリ（破砕のごみ）の減少が期待される。

液体窒素で急速凍結し、乳鉢にてすり潰したもの

乳鉢ですりつぶした場合、固い葉の組織なども完全に粉砕されている。完全に破砕すると間違いなくRNAが取れるという安心感が得られる一方で、 葉脈などはデブリの原因になるがこれまでは代替手段がなかった。

ｂ. 各サンプルから抽出されたRNAの電気泳動
　 抽出したRNAの電気泳動写真は下記の通り。

＜分裂酵母RNAの泳動結果＞
	レーン1：100bpマーカー レーン2：ガラスビーズ破砕、＋液体窒素凍結 レーン3：ガラスビーズ破砕、−液体窒素凍結 レーン4：ジルコニアビーズ破砕、＋液体窒素凍結 レーン5：ジルコニアビーズ破砕、−液体窒素凍結 レーン6：金属製クラッシャー破砕、＋液体窒素凍結 レーン7：金属製クラッシャー破砕、−液体窒素凍結

＊結果・考察
ガラスビーズ、ジルコニアビーズ、金属クラッシャーの各破砕ツールでRNAが確認された。RNAは28Ｓ、18Ｓのバンドが鮮明に見えており精度よく回収されており酵素による分解も確認されなかった。 金属クラッシャーにおいては、液体窒素で凍結しないサンプルからもRNAが確認された。この結果は、金属クラッシャーの破砕様式がビーズによるものと異なることを示唆している。ビーズ破砕の場合、撹拌に伴うビーズと細胞のランダムな衝突によって細胞が破砕されるのに対し、金属クラッシャーでの破砕の場合、金属クラッシャーがチューブの中で上下に動く運動と、チューブの中で石臼のように回転する運動が確認された。こうした金属クラッシャーのチューブ内での運動が細胞を破砕する上で効果的であると考えられる。

＜植物体（アラビドプシス）から抽出したRNAの泳動結果＞
	レーン1：ジルコニアビーズ破砕 レーン2：金属クラッシャー破砕 レーン3：乳鉢で破砕 レーン4：1kbpマーカー

＊考察
・28Ｓ、18Ｓのバンドが鮮明に見えておりアラビ植物体からよくRNAが抽出できている。 各レーンは２０μLのDEPC水に溶かしたサンプルを2μLづつアプライしたもの。 RNA収量も高く、ジルコニアビーズは乳鉢とほぼ同等、金属製ブレッドでは更に効率よく回収できている。

まとめ