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サイト更新情報 : サイト更新情報 : 実験データに「CHO-S細胞のBD Select CHO 培地を用いたバッグ培養によるスケールアップ」をアップしました。
抗体や組換えタンパク質を生産するバイオプロセスにおいてスケールアップには一般に以下の問題が伴う。
１）培養効率の低下
２）容器および装置の変更
３）１、２を解消するための条件検討とそれに要する時間とコストの増加
特に動物細胞培養ではその傾向が顕著であり、細胞株／培地の組合せにも大きく依存する。
BD Select CHO（日本ベクトン･ディッキンソン）は、培地最適化プログラムによって新しく開発されたCHO細胞用の無血清培地であり、高い物質生産効率を期待できる。一方、リサーチツール.JPの過去の記事（カルチャーバッグによるハイブリドーマの培養）にはハイブリドーマ培養のスケールアップでの培養バッグの有用性が記載されている。
本実験では、スケールアップ時に装置の更新を伴わない三角フラスコ／培養バッグ兼用培養装置を用いて、大規模な組み換えタンパク質の発現に広く使われているCHO細胞の、BD Select CHO培地での三角フラスコから培養バッグへのスケールアップについて検証した。
2010-11-25 10:37:35
サイト更新情報 : 実験データに「アプリケーションノート：原核生物からの効率的なプラスミドDNA精製」をアップしました。
プラスミドDNAは分子生物学とタンパク質研究に欠かせない要素です。この比類のないツールは分子生物学研究の根源であり、さまざまな宿主で組み換えタンパク質を発現させるために必要になります。各用途により必要となるプラスミドの量は変わりますが、精製は通常小スケールでの培養から開始します。かつて必要だった大スケールでの精製は、クローニング技術の進歩により小スケールで十分になり、プラスミドやミニプレップの処理数が大きく増加しました。現在では小スケールでの開発、すなわち半自動化または完全自動化を必要とする多検体処理が広く行われています。
様々なメーカーから、小スケールから大スケールに対応したプラスミド精製キットが販売されています。96ウェルフォーマットと同様、ミニプレップは単一の遠心チューブで行うことが出来ます。しかし完全にキット化された方法によって、エンドユーザーはコストアップを強いられています。そこでわれわれは大腸菌の培養液から効率的に清澄化、及びプラスミドDNA精製を行う費用効果の高い方法を開発しました。それは、最適化されたフィルタープレートによる溶解液の清澄化に続いて、高いDNA結合容量を持つフィルタープレートを使う精製方法です。
プラスミドDNAの精製では、細胞を溶解し、塩類を加えて界面活性剤を塩析させた後、サンプルを清澄化します。この清澄化ステップは細胞断片を除去するために必要です。遠心チューブを用いて精製を行っている場合には、通常、細胞断片の分離に遠心分離が用いられます。しかし遠心分離ではプラスミドDNAの精製をハイスループットで行おうとするとさまざまな問題が生じます。まずマルチウェルプレートでは細胞破片（通常ふわふわの浮遊物）をペレット化して上澄みを回収することはほとんど出来ません。また遠心分離には時間がかかること、ローターの許容サンプル数、マイクロチューブを使うことによる操作の煩雑さなどの問題があります。そして最大の問題は、堆積物がふわふわのペレットであるため、目的のプラスミドDNAの大部分をトラップしてしまうことです。
プラスミド精製プロセスにおけるDNA結合には、シリカベースのメディアとガラス繊維のメンブレンを使うことが標準的になっています。この方法ではカオトロピック塩がDNAの結合を促進し、中性のバッファー（TE Bufferや水など）でDNAを溶出する前に汚染物質を容易に除去することが出来ます。シリカベースのメディアを含むフィルタープレートを使えば、吸引濾過や遠心分離で目的量のプラスミドDNAを容易に得ることが出来ます。
自動化が容易な吸引濾過では、より早く処理でき、サンプル回収を最大にする洗浄ステップを追加することが可能です。濾過は吸引濾過または遠心分離で効果的に行うことが出来ます。そして、研究者が利用できるプロトコールの選択肢を比類のないほど最大限に広げます。このアプリケーションノートでは、DNA精製を吸引濾過法と遠心分離法で比較します。さらに、溶解液の清澄化に絶大な効果を示す、プレフィルターを持つフィルタープレートの有用性を示します。溶解液はプレフィルターによる濾過によって効率的に清澄化され、その画分が即座にDNA結合プレートへと移動します。
以下のプロトコールでは96サンプルプラスミド精製の、原核生物の培養液から始まり高純度DNAを得て終了するまでの一連のプロセスを示します。マルチウェルプレートでの濾過で行う溶解液清澄化とDNA精製は、プラスミド調製のプロセスを効率化するでしょう。この方法は、手動、半自動または完全自動のいずれにも適用することが出来ます。
2010-11-8 11:29:25
サイト更新情報 : 実験データに「CHO-S細胞のBD Select CHO 培地への馴化プロセスの検証」をアップしました。
細胞培養用の無血清培地は血清入りの培地と比べ、不要なタンパク質の混入を避けることができる、血清のロット差を気にせず安定した性能が得られるなどの大きな利点があり、近年数多くの無血清培地が開発され使用されている。 各試薬メーカーではそれぞれ特色のある無血清培地を販売しているが、相互の互換性は乏しく、他の培地への急激な変更は増殖不良や細胞死を引き起こすことが多い。このため、使用する培地を変更する場合には、段階的な馴化ステップが必要となるが、必ずしもその過程は確立されているとはいえない。
BD Select CHO（日本ベクトン･ディッキンソン、BD）は、培地最適化プログラムによって新しく開発された、高い収率が期待できるCHO細胞用の培地である。BD Select CHOは基礎培地及び加水分解物の双方が最適化されており、動物由来成分非含有で、cGMP CFR820に準拠した工程で製造されている。 本実験では、CHO-S細胞を別の無血清培地からBD Select CHOへ馴化させ、そのプロセスを検証したので紹介する。
2010-11-2 9:21:44
サイト更新情報 : 実験データに「合成リガンドレジンMEP HyperCelによる抗体精製 ―効率的なアルブミン除去方法の検討―」をアップしました
合成リガンドレジンMEP HyperCelによる無血清培地からのマウスIgG1の精製を報告する。 MEPはProtein AやProtein Gと比べて
1.由来生物種や抗体のサブクラスが不問
2.弱酸性溶出（pH4で溶出、Protein AやProtein GはpH2.8前後が一般的）でタンパク質の失活リスクを低減
3.アルカリ洗浄による繰り返し使用
4.生物由来材料の不使用 の点で有利である。
しかし、イオン交換疏水的相互作用を基盤とした精製なので、蛋白質種が多い場合は高純度に精製することはできない。無血清培地でも比較的高濃度のアルブミンを含む培地も多く、合成リガンドによる精製では抗体と分離できないことが多い（参考資料）。
本実験では、精製工程にオクタン酸ナトリウムによる洗浄を加えることにより、アルブミンの除去を試みた。その結果、89.2%のIgG1精製画分を得ることができた。工程の追加によるIgGのロスも認められないことから、洗浄工程の追加により初期精製においてMEP HyperCelで十分な性能を発揮できることがわかった。
2010-6-9 11:01:47
サイト更新情報 : 実験データに「ディスポーザブルなプラスチック製BD Falcon 三角フラスコを用いた293細胞の培養とタンパク質発現」をアップしました
三角フラスコは動物細胞や酵母・バクテリア等の浮遊培養を数十mL～数百mLスケールにて行う際、広く培養容器として用いられている。従来よりのガラス製フラスコに加えて、近年ではプラスチック製のディスポーザブルな三角フラスコがコンタミネーションリスクの低減、軽さと丈夫さ、洗浄の手間を省けるなどの利点からよく用いられるようになっている。
BD Falcon三角フラスコは光学的透明性に優れたポリカーボネート製の本体と、ガス交換が可能なベンテッドキャップと密閉キャップが一体化した斬新なキャップが付属した滅菌済みのフラスコである。今回はこのBD Falcon 三角フラスコを用い、FreeStyle 293-F細胞の培養とタンパク質の発現を行い、その効率を検討したので紹介する。
2010-5-19 9:59:54
サイト更新情報 : 実験データに「タンジェンシャルフローろ過システム(TFF)による培養上清濃縮液の調製」をアップしました
蛋白質の精製において、カラムクロマトグラフィーの前の試料処理は、得られる精製産物の純度や操作の再現性、カラムのコンディション維持などのために重要である。
ハイブリドーマ培養液からのモノクローナル抗体精製の場合、まず培養液から培養上清と細胞を分離し、次に培養上清の濃縮や脱塩の工程を経る。数100 mLまでの小スケールの場合、細胞分離に遠心分離、濃縮に遠心タイプの限外ろ過デバイス、脱塩には同じく限外濾過デバイスもしくは透析膜が用いられることが多い。しかし、遠心分離の操作はローターの大きさにより処理量が制限され、透析膜による透析には時間がかかること（0.5-2日）やサンプルのロスが多いなどの欠点がある。
本実験では、これらの解決手段としてのタンジェンシャルフローろ過(TFF)システムの有用性を検証した。
TFFは、試料溶液をろ過膜表面に平行に流して浸透させるろ過方式である。遠心ろ過デバイスのようなダイレクトフィルトレーション(DFF)では、膜に対して水平に試料を供給することから、分子量の大きい分子が滞留し目詰まりが多く生じ、試料の処理速度が急速に低下することがある。一方、TFFでは膜表面に保持される試料中の分子を掃きながらろ過することにより、膜の目詰まりを防ぎ、単位膜面積当たりの処理容量が多いという利点がある。
今回は、500 mLのハイブリドーマ培養液を出発材料に、TFFシステムを使い培養上清と細胞の分離および培養上清を濃縮、脱塩を行った。その結果、約3時間でモノクローナル抗体をロスすることなく一連の操作を完了することができた。
2010-3-18 15:01:24
サイト更新情報 : 実験データに「無血清培地へのYeastlate添加によるsf-9細胞の増殖率・タンパク産生量向上の検討」をアップしました
sf-9昆虫細胞はバキュロウィルスによるタンパク質の大量発現に使用される細胞である。sf-9細胞は培養にCO2が不要であり、インキュベーターのみで手軽に培養が可能である。またバキュロウイルスは脊椎動物・植物には感染せず、組換え型ウイルスは外界で容易に不活化されるため安全性が高い利点をもち、sf-9とバキュロウィルスの組み合わせにより手軽に真核生物のタンパク質発現系を使用することができる。sf-9細胞の培養にはグレース培地等の基礎培地に5～10％の血清を加えたものが古くから使用されているが、コストの削減や不要なタンパク質の混入を避けるために、近年数多くの無血清培地が開発され使用されている。血清の代わりにLipid emulsionやpeptone等のタンパク質加水分解物、yeastolateの添加などが行われており、中でもyeastolateはsf-9細胞の増殖やバキュロウィルス感染によるタンパク質産生効率の向上に大きな効果があることが知られている。
本実験では、組成が公開されているsf-9細胞用の無血清培地IPL-41mediumにyeastolateを加え、sf-9細胞の増殖率やタンパク質産生量の大幅な向上を確認した。また、培地に加えるyeastolateにはエンドトキシン等を除去するためにMW 10K以上の物質をCutoffする限外ろ過処理が必要であるが、予め限外ろ過済みの製品を使用した場合と、非限外ろ過製品を自ら調整した場合とも併せて比較したので紹介する。
2009-9-29 17:23:26
サイト更新情報 : 実験データに「カルチャーバッグによるハイブリドーマの培養」をアップしました
動物細胞の培養の容器はスケールに応じて、マイクロプレート（数mL以下）、細胞培養フラスコ（数mL～数10mL）、三角フラスコ（数10mL～数100mL）、ジャー培養（数L以上）が用いられる。近年、三角フラスコとジャー培養をつなぐスケールあるいはジャー培養の代替として、使い捨てのバッグによる培養システムが利用され始めている。バッグ培養は初期費用が安いことや、使い捨て容器使用による滅菌の保証の面でジャー培養と比較して有利であり、局方対応のバッグを用いればバイオ医薬品の製造への適応も可能である。一方で、バッグ培養の実績は多くなく、細胞の増殖効率や物質産生能のなどの検証データは少ない。
本実験では、藤森工業社製カルチャーバッグとタイテック社製の強制通気型CO2インキュベーターの組合せでハイブリドーマ細胞の培養を行った。その結果、三角フラスコでの振とう培養と同等の増殖効率、抗体産生が得られた。
2009-9-29 13:53:12
サイト更新情報 : 実験データに「ハイブリドーマ細胞の無血清培地への馴化プロセスの検証」をアップしました
細胞培養での無血清培地の使用は、血清のロット差を気にせず再現性のある安定した性能が得られる点や、産生物の精製の際に邪魔になる大量の血清由来蛋白質成分がない点などで有利である（図１）。近年では抗体や組換え蛋白質の産生に特化した大量発現用の培地が各メーカー（日本ベクトンディッキンソン、インビトロジェンなど）より発売されている。
しかし、細胞が無血清培地に充分に馴化していなければ、期待される増殖効率や物質産生が得られず、培地の特長を生かすことはできない。細胞の培地へ馴化作業は、無血清培地では成分が明らかにされていないこともあり、手間がかかるが、大量発現系の確立などでは最初の重要なステップとなる。
そこで、本実験では日本ベクトンディッキンソンのハイブリドーマ培養用の無血清培地を例に、馴化プロセスを検証した。
その結果、無血清培地では試験した条件ではいずれも１週間以内に培地への馴化に成功した。
2009-8-27 17:31:34
サイト更新情報 : 実験データに「無細胞膜蛋白質キットMembraneMAX Protein Expression kitによる各種膜蛋白質発現の試み」をアップしました
膜内在型の蛋白質は生体内の蛋白質種の約30%を占める。膜蛋白質は細胞の内と外との物質や情報のやり取りを介することにより、信号伝達、エネルギー産生、細胞増殖などの生物機能に本質的な役割を果たしている。創薬の標的の50%以上はこれら膜蛋白質ともいわれ、研究対象として非常に重要視されている。
しかし、一般に個々の膜蛋白質は生体に微量にしか含まれず、天然蛋白質の解析は困難である。大腸菌や酵母など異種細胞で組換え蛋白質の大量発現を試みても、封入体など活性を持たないミスフォールドされた蛋白質が得られる例が非常に多く、試料の調製が膜蛋白質研究のボトルネックとなっている。
本試験では無細胞膜蛋白質発現キット（MembraneMAX protein expression kit、インビトロジェン）を用いてモデルケースとして3つの膜蛋白質、イオンチャネル（膜２回貫通；2TM）、イオンポンブ（7TM）およびトランスポーター（12TM）の発現を試みた。
その結果、12TMのトランスポーターの発現は認められなかったものの、2TMのイオンチャネルおよび7TMのイオンポンプについては比較的高レベルの発言が認められた。これらの組換え蛋白質は膜類似構造体であるNLPに埋め込まれた構造として得られた。
2009-6-2 8:21:40
